4月17日，國際學(xué)術(shù)期刊Acta Pharmacologica Sinica在線發(fā)表了中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所楊黃恬研究團(tuán)隊的研究論文“A simple and efficient method for purification of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via activating p53”。該研究利用人多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞（hPSC-CMs）與非心肌細(xì)胞對p53信號通路的不同耐受性建立了通過激活p53高效、簡便純化hPSC-CMs的方法。
hPSC-CMs在研究人心血管發(fā)育、疾病建模、藥物篩選和毒性、細(xì)胞治療等領(lǐng)域具有重要價值。獲得高純度hPSC-CMs對于其應(yīng)用至關(guān)重要。利用富含乳酸、無葡萄糖且營養(yǎng)貧乏的純化培養(yǎng)基（乳酸法）純化hPSC-CMs已被廣泛使用，但這種方法在純化過程中可致心肌細(xì)胞出現(xiàn)“缺血樣”表型，表現(xiàn)為自發(fā)性心律失常、異常鈣信號和肌節(jié)縮短。此外，大多數(shù)應(yīng)用需要hPSC-CMs具有更高的成熟度，這需要延長培養(yǎng)時間。然而，早期純化后殘留的非心肌細(xì)胞仍在增殖，長時間培養(yǎng)使得hPSC-CMs純度降低, 而乳酸法對較長時間分化的hPSC-CMs純化能力幾乎喪失。因此，亟需發(fā)展?jié)M足以上應(yīng)用需求的替代純化方法。
通過比較幼稚心肌與成年心肌轉(zhuǎn)錄組，并結(jié)合實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)p53信號通路在成年心肌細(xì)胞中顯著上調(diào)，表明心肌細(xì)胞可以耐受p53信號激活引起的細(xì)胞死亡，因此提出假設(shè)：利用心肌細(xì)胞與非心肌細(xì)胞對p53信號激活導(dǎo)致細(xì)胞死亡的耐受性不同，可以通過激活p53通路純化hPSC-CMs。研究人員首先測試了不同濃度p53激動劑nutlin-3a處理2天后恢復(fù)4天對hPSC-CMs的純化作用：隨著nutlin-3a濃度提高心肌細(xì)胞比例顯著增加，證明p53激活可純化hPSC-CMs，其對分化早期hPSC-CMs的純化效果與乳酸法類似，但對分化20天后hPSC-CMs的純化能力明顯優(yōu)于乳酸。研究人員進(jìn)一步證明nutlin-3a即使處理4天在不高于20 μmol/L濃度處理時未增加心肌細(xì)胞死亡，而40μmol/L?nutlin-3a處理4天可引起hPSC-CMs死亡；免疫熒光染色及動作電位分析進(jìn)一步顯示20 μmol/Lnutlin-3a對?hPSC-CMs肌絲結(jié)構(gòu)與電生理特征無明顯影響，證明20 μmol/L及更低的nutlin-a濃度對hPSC-CMs無明顯毒副作用。殘留未分化的hPSCs對hPSC-CMs用于心臟疾病細(xì)胞治療帶來潛在的成瘤風(fēng)險。未分化hPSCs對p53激活極為敏感，在nutlin-3a處理下快速發(fā)生死亡；研究人員進(jìn)一步測試nutlin-3a處理是否可用于去除hPSC-CMs中的未分化細(xì)胞。堿性磷酸酶染色顯示相較常規(guī)乳酸法純化法，p53激活純化在去除未分化細(xì)胞上具有顯著優(yōu)勢，且經(jīng)nutlin-3a處理的hPSCs與hPSC-CMs混合注射無法形成畸胎瘤，證明該方法可去除未分化細(xì)胞。最后，研究人員證明nutlin-3a在3株人胚胎干細(xì)胞系及1株人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系來源的心肌細(xì)胞均有高效純化效果，表明激活p53純化hPSC-CMs的通用性。
綜上，研究人員開發(fā)了一種新的hPSC-CMs純化方法，其具有如下優(yōu)點（1）該方法操作簡便、通用、適用于早期及之后（超過20天）分化的hPSC-CMs高效純化；（2）有效去除未分化的hPSCs，從而提高hPSC-CMs在細(xì)胞治療中的安全性；（3）純化后的細(xì)胞具有正常的形態(tài)和電學(xué)特性。該方法可用于降低hPSC-CMs在藥物篩選、毒性檢測、疾病模擬和機制研究中的差異性，也為心臟疾病的細(xì)胞再生治療提供更安全的種子細(xì)胞。
中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所楊黃恬研究員、張鵬副研究員為本論文的共同通訊作者；張鵬副研究員、博士畢業(yè)生饒森樂為該論文的共同第一作者。該研究得到了浙江大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院梁平教授及王曉晨助理研究員、上海市東方醫(yī)院賈文文教授及魯濟(jì)真博士、中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所所級公共技術(shù)中心分析測試技術(shù)平臺的支持和幫助。該研究獲得國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院青年研究促進(jìn)會及浙江省“領(lǐng)雁”研發(fā)攻關(guān)計劃基金支持。
論文鏈接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40247037/
圖注：簡便高效的hPSC-CMs的純化方法。a，長時間培養(yǎng)的hPSC-CMs純度下降。b，乳酸純化法對分化第21天的hPSC-CMs純化作用微弱。c，nutlin-3a可用于長時間分化的hPSC-CMs純化。d，nutlin-3a相比乳酸純化方法有更好的去處未分化hPSCs效率。e，nutlin-3a純化的心肌細(xì)胞移植免疫缺陷型小鼠無畸胎瘤形成。f，nutlin-3a可用于多種hPSC系來源的心肌細(xì)胞。
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